В области биоферментации стеклянные ферментационные емкости всегда были предпочтительным оборудованием для специалистов по оптимизации процессов, особенно на лабораторном и мелкомасштабном этапах. Стеклянные ферментационные емкости прозрачны и интуитивно понятны, легко чистятся и относительно доступны по цене, удовлетворяя потребности в культивировании большинства микроорганизмов. Особой популярностью пользуются стеклянные ферментационные емкости объемом 5 л.
I. Материал емкости Выбор подходящей стеклянной ферментационной емкости начинается с рассмотрения материала емкости. Высокоборосиликатное стекло в настоящее время признано лучшим выбором, поскольку оно сочетает в себе химическую стабильность, термические свойства и физическую прозрачность. Процесс ферментации по сути представляет собой метаболическую активность микроорганизмов в искусственной среде. Ферментационная среда имеет сложный состав, включающий неорганические соли, буферные системы, органические кислоты, ферменты и метаболиты, выделяемые микроорганизмами. Высокоборосиликатное стекло, благодаря добавлению большого количества триоксида бора в процессе его производства, образует высокостабильную кремний-кислородную сетчатую структуру, обеспечивающую ему чрезвычайно высокую устойчивость к воде, кислотам, щелочам и различным органическим растворителям. Эта инертная емкость не пропускает дополнительные элементы в ферментационную среду и не адсорбирует ее эффективные компоненты, тем самым обеспечивая достоверность данных и стабильность партии.
С точки зрения тепловых свойств, высокоборосиликатное стекло решает наиболее критическую проблему надежности стеклянных материалов. Ферментационные емкости почти всегда подвергаются высокотемпературной стерилизации, и емкости должны циклически переключаться между комнатной температурой, температурой стерилизации и температурой культивирования. Эти резкие перепады температуры предъявляют чрезвычайно высокие требования к устойчивости материала к термическому шоку. Высокоборосиликатное стекло имеет коэффициент теплового расширения, составляющий лишь около одной трети от коэффициента теплового расширения обычного стекла, что позволяет ему выдерживать мгновенные перепады температур в сотни градусов Цельсия без повреждений.
С точки зрения наблюдения за процессом, прозрачность высокоборосиликатного стекла придает ему уникальное преимущество, которое не может заменить ни один металл. Операторам необходимо постоянно контролировать изменения состояния резервуара, а высокоборосиликатное стекло не только обладает высокой светопроницаемостью, но и не желтеет при длительном использовании, сохраняя стабильно хорошее поле зрения. Через стенки резервуара специалисты могут напрямую оценить равномерность перемешивания, высоту пенного слоя, слипание или прилипание микроорганизмов и даже определить метаболическое состояние по изменению цвета. Эта интуитивно понятная визуальная информация часто более прямая, чем данные датчиков.
II. Объем
Номинальный объем 5-литрового стеклянного ферментера относится к общему объему резервуара в 5 литров, но фактическое заполнение жидкостью обычно контролируется на уровне около 70%, что составляет приблизительно 3,5 л культуральной среды. Если емкость заполнена слишком плотно, пена склонна к переливанию во время перемешивания, засорению вытяжного фильтра и даже загрязнению; если же заполнена слишком слабо, это негативно сказывается на экономической эффективности. Соотношение диаметра к высоте часто упускается из виду; наиболее распространенная конструкция имеет узкую форму с соотношением примерно 1:2,2–1:2,5. Это соотношение может увеличить время пребывания пузырьков воздуха в жидкости, улучшить коэффициент переноса кислорода (значение kLa) и особенно подходит для высокоплотной культуры аэробных микроорганизмов, таких как E. coli, дрожжи или Bacillus subtilis. Если ваш эксперимент чувствителен к сдвиговым нагрузкам (например, некоторые грибы или клетки животных), вы можете выбрать немного меньшее и большее соотношение, но в целом 1:2,5 является наиболее сбалансированным вариантом.
III. Методы стерилизации
Метод стерилизации является решающим фактором при выборе лабораторных стеклянных банок. В настоящее время наиболее распространенным методом стерилизации 5-литровых стеклянных ферментеров в лабораториях является стерилизация вне лаборатории. Процедура включает в себя сначала снятие верхней крышки реактора из нержавеющей стали, заливку предварительно приготовленной культуральной среды, герметизацию крышки и, наконец, помещение всего ферментера (включая корпус резервуара, электроды, емкости для подачи корма, трубки и другие принадлежности) в автоклав для стерилизации. Преимуществами являются простая конструкция реактора и низкая себестоимость производства (на 30–100% дешевле, чем стерилизация на месте); она подходит для большинства сценариев обучения, скрининга штаммов и рутинных исследований. Недостатком является необходимость разборки, сборки и обработки до и после каждого эксперимента, что занимает много времени. Хотя стерилизация вне места проведения эксперимента несколько более трудоемка, она обеспечивает высокую экономическую эффективность; если автоклав вмещает 5-литровый резервуар и принадлежности, стерилизация вне места проведения эксперимента является оптимальным решением.
Стерилизация на месте проведения эксперимента предполагает прямую подачу высокотемпературного пара в ферментер и рубашку после установки через встроенные паропроводы, клапаны и систему управления оборудования. Это исключает необходимость разборки и особенно подходит для процессов, требующих частой смены партий или экстремальной стерильности для валидации масштабирования. В стеклянных ферментерах быстрый нагрев/охлаждение и колебания давления во время стерилизации на месте создают значительные термические напряжения, легко приводящие к нарушению герметичности соединения или повреждению электродов. Оборудование также требует дополнительных парогенераторов, автоматических клапанов, датчиков давления и усиленной стеклянной конструкции, что значительно увеличивает затраты. Ремонт в случае возникновения проблем также затруднен. Поэтому стерилизация на месте относительно редко встречается в стеклянных резервуарах и в основном применяется в резервуарах из нержавеющей стали.
IV. Система перемешивания.
Система перемешивания определяет равномерность перемешивания, перенос кислорода и контроль силы сдвига и является «сердцем» ферментера. Для 5-литровых стеклянных реакторов, используемых для микробной ферментации, для перемешивания обычно используется серводвигатель постоянного тока мощностью 100-300 Вт или двигатель переменного тока с регулируемой частотой. Эти двигатели небольшие, малошумные, не требуют технического обслуживания и обеспечивают точное бесступенчатое регулирование скорости. Они также поддерживают цифровое ПИД-регулирование, облегчая связь с контроллером ферментации для регулировки растворенного кислорода и силы сдвига. Следует избегать обычных асинхронных двигателей из-за низкой точности регулирования скорости, которая не может соответствовать требованиям ферментации в отношении стабильности и повторяемости скорости.
Механические уплотнения являются распространенным методом динамической герметизации в системах перемешивания стеклянных ферментеров, в основном используемым в системах механического перемешивания с верхним входом. Механические уплотнения можно разделить на односторонние и двухсторонние. Первые состоят только из одного комплекта вращающегося кольца (вращающегося вместе с валом) и неподвижного кольца (закрепленного на крышке резервуара), используя самосмазывание культуральной среды внутри резервуара. Они имеют простую конструкцию, низкую стоимость и эффективную передачу крутящего момента, что делает их подходящими для лабораторных стеклянных реакторов. Вторые основаны на двух комплектах торцевых уплотнений, соединенных последовательно, образующих промывочную камеру посередине, через которую подается специальная герметизирующая жидкость, создавая двойной барьер. Даже при небольшой внутренней протечке внешние загрязнения не могут проникнуть внутрь, что обеспечивает более высокий уровень гигиены.
Метание с магнитной муфтой снизу — распространенное асептическое решение для перемешивания в 5-литровых стеклянных реакторах для микробной ферментации. Наиболее существенное визуальное отличие заключается в отсутствии двигателя на верхней крышке, в то время как реактор имеет дополнительное основание. Двигатель установлен снизу, и внешнее магнитное кольцо вращается вместе с двигателем, приводя в движение внутреннее магнитное кольцо (интегрированное с валом мешалки и импеллером) посредством сильного магнитного поля. Это предотвращает проникновение вала мешалки в стенки или крышку резервуара, исключает необходимость в механических уплотнениях или сальниках и обеспечивает полностью бесконтактную передачу. Преимущества магнитного перемешивания включают в себя исключительную стерильность, полное устранение застойных зон и рисков утечки, связанных с проникновением вала, отсутствие износа уплотнений, отсутствие необходимости в регулярной замене или смазке уплотнительных колец и длительный срок службы. Кроме того, он обеспечивает осевое и радиальное перемешивание снизу вверх, что приводит к более равномерному распределению газа (при использовании с кольцевой струей) и часто к более высокой скорости переноса растворенного кислорода (kLa), особенно при работе с средами малого объема или высокой вязкости. Сила сдвига относительно невелика, что делает его более подходящим для чувствительных штаммов (таких как некоторые нитевидные грибы). Недостатком является риск разъединения магнитной муфты. Если вязкость среды слишком сильно увеличивается, скорость вращения слишком высока или нагрузка слишком велика, внутреннее и внешнее магнитные кольца могут на мгновение отсоединиться, что приведет к остановке перемешивания. Тщательный выбор системы магнитного привода с высоким крутящим моментом необходим для ферментации с высокой плотностью или высокой вязкостью (например, содержащей твердые частицы).
Для большинства лабораторных микробиологических ферментаций в 5-литровых стеклянных реакторах механическое перемешивание в сочетании с односторонним механическим уплотнением является наиболее экономичным и практичным вариантом. Оно простое, надежное и легкое в обслуживании, и подтверждено многочисленными производителями. Переход на мешалки с двойными механическими уплотнениями или магнитной муфтой с нижним расположением рассматривается только в ситуациях, требующих высоких асептических условий, работы с микроорганизмами высокого риска или специальных технологических процессов, для обеспечения дополнительной безопасности.
V. Рабочие колеса
Рабочее колесо является ключевым компонентом, влияющим на равномерность перемешивания, коэффициент переноса кислорода (kLa), силу сдвига и энергопотребление. Материал рабочего колеса — нержавеющая сталь 316L с электрополированной поверхностью. Основной принцип выбора — баланс между высоким переносом кислорода (необходимым для аэробных микроорганизмов) и низким сдвигом (защита микробных клеток).
Турбинные рабочие колеса являются наиболее распространенным выбором для микробной ферментации. Они в основном создают радиальный поток, разрушают пузырьки и значительно увеличивают значение kLa, что делает их подходящими для ферментации с высокой плотностью и высокими потребностями в кислороде (например, для E. coli и дрожжей). Их сильное газораспределение и высокая эффективность переноса кислорода подтверждены многочисленными исследованиями и различными производителями. Недостатком является то, что высокие скорости могут повредить нитевидные грибы или чувствительные штаммы.
Наклонные лопастные импеллеры устанавливаются под углом приблизительно 45°, создавая одновременно радиальный и осевой потоки, что приводит к более равномерному перемешиванию. Они обладают меньшей силой сдвига, чем турбинные импеллеры, и обеспечивают лучшую передачу кислорода. Они подходят для культуральных сред средней вязкости или микроорганизмов, которые несколько чувствительны к сдвигу. При использовании в сочетании с турбинным импеллером с меньшим диаметром лопаток улучшается общая циркуляция и уменьшаются застойные зоны. Недостатком является несколько меньшая способность к диспергированию газа по сравнению с чистым турбинным импеллером.
Осевые импеллеры в основном создают осевой поток, что приводит к наименьшей силе сдвига, делая их подходящими для культивирования с низкой вязкостью и низким сдвигом. Осевые импеллеры имеют меньшую мощность и более высокую энергоэффективность, что делает их подходящими для нитевидных грибов или штаммов, очень чувствительных к сдвигу. Процесс перемешивания относительно щадящий, с меньшим пенообразованием и меньшим энергопотреблением. Недостатками являются относительно меньшая дисперсия газа и значение kLa, что делает их непригодными для быстрорастущей ферментации с чрезвычайно высокими потребностями в кислороде.
Наиболее распространенная и рекомендуемая конфигурация для стеклянного ферментера объемом 5 л — это комбинированная 2-3-слойная система мешалок: нижняя турбинная мешалка для диспергирования газа, разбивающая поступающий газ на микропузырьки; верхняя мешалка с наклонными лопастями для осевой циркуляции, предотвращающая осаждение клеток и равномерно распределяющая диспергированные пузырьки из нижнего слоя по всему резервуару; также может быть добавлена механическая пеногасящая мешалка.